帝肯TECAN:如何开发最佳的荧光检测方案 作者:admin| 发布时间:2017-04-10 | 点击次数533次

By Stefan Haberstock博士

借助荧光检测技术您可以进行一些极端敏感,高稳健性且具有广泛动态范围的检测实验,而试验的成功取决于下文所述的几点:激发波长(Ex)和发射波长(Em)的谨慎选择,灵活敏感的光学器件的选用。

优化荧光检测—荧光信号的最大化,背景干扰的最小化和任何一种检测方法一样,荧光测量法成功的关键就在于通过提高信号噪声比(S/N)来实现灵敏度的提高。在特定的测量过程中,S/N比极大地取决于染料激发(Ex)和发射(Em)波长的特点以及使用时设置的波长和带宽。

每一个荧光基团都有Ex光谱, 而正是Ex光谱能决定哪些照明波长可以用来最大限度地激发该基团。反过来讲, 荧光基团的Em光谱能决定荧光最强时的波长。两个(Ex和Em)最优波长之间的差异叫做斯托克斯位移。

 

斯托克斯位移是荧光检测高灵敏度的基础

使用适当波长的滤光片或可以自主选择波长的光栅,我们可以将Ex和Em设置为与最适宜染料相同或相似的波长。选择最优波长的精准度取决于带宽。例如,带宽为20nm的光栅,设置其波长为450nm,那么它会让波长在 440-460nm之间的光束通过。

 

 

带宽决定了波长选择的精确度。带宽20nm意味着在高斯曲线高度的一半处波长为+10nm,而在曲线底部波长将会是+20nm。

当染料的斯托克斯位移小于带宽之和(Ex + Em)时,对最优Ex和Em的选择很可能导致间隔或重叠。也就是说,用于Ex的光束将会通过Em滤光片或光栅到达光电倍增管(PMT),导致错误的假阳性结果。
 


Ex和Em带宽的重叠导致假阳性结果


因为狭窄的带宽总能使最优Ex和Em被选入,所以窄带宽看上去是更为可取的。但狭窄的带宽也降低了能量输入、检测限度和S/N比。大多数情况下,当Ex和Em的带宽在15–20nm左右,且波长设置不以优化Ex和Em为目的的时候,仪器能提供最佳的检测限度和S/N比。


以Ex和Em带宽间的最佳距离(Ex + Em + 5nm)设置波长,来防止重叠并产生最佳的检测限度和S/N比。

荧光基团会受所处环境影响

染料的Ex和Em特性能被与其结合的分子以及所处环境的理化性质所影响。环境因素包括温度,离子强度和pH值。因此,优化检测方案应包括应用光栅扫描Ex和Em,以确定在某特定条件下染料的最佳Ex和Em值。

一般来说,光栅的灵敏度要低于滤光片,这进一步导致了我们在开发检测方案的过程中对灵敏度的要求的降低。通常情况下,在一次测量过程中我们仅扫描Ex和Em的带宽。因此,当我们使用滤光片记录染料最大激发波长或发射波长时,理想化的光学系统将会是滤光片和光栅的组合。

强大的多重分析技术,需要强大的光电倍增管支持

多重样本分析的荧光检测技术能够在多种情况下使荧光检测技术成为一种选择。但如上文所述,光谱的重叠能通过引入干扰而降低检测的灵敏度。尤其是在一次检测中使用多种染料(多重分析) 的情况下,这一点变得更为重要,并且我们需要特别注意对染料的选择。由于荧光技术的广泛普及,许多染料和许多版本的荧光蛋白现已可以让我们在全光谱范围中使用。

在本文中,光电倍增管 (PMT) 的光谱性能显得尤为重要。许多PMT已为荧光技术进行了优化,能在发出波长在500nm上下的绿光。但是,那些能够发射波长超过600nm红光的染料对优化后的PMT仍是一个难题。这就可能会导致检测敏感性的显著降低,而作为补偿,我们需要使用更高浓度的反应物,进而增加了实验费用且降低了检测技术的鲁棒性。如果您想进行多重样本分析的话,您需要对PMT的光谱响应多加留意。